微球共价偶联

微球共价偶联

一，引言

当包被微球时，许多策略可以考虑，包括共价偶联，吸附和亲和力结合。每种方法都有其优点和缺点，应在研究目标，试剂要求，技术人员/实验室专业知识，时间表等背景下加以考虑。

当需要非常活跃和稳定的微球试剂时，共价偶联通常用于固定生物分子。因为：

•      生物分子是永久性结合的，不会随着时间的推移而解吸/浸出；

•      消除微球之间的“串扰”，可以进行多重测试和测定；

·      配体有利地存在于珠子的表面上，使得结合部分可用于与靶分子相互作用；

•      结合动力学可以接近基于溶液的结合动力学。

由于在本技术说明的范围内不可能充分解决每种类型的生物分子与每种类型的微球之间的最佳偶联，因此我们旨在为研究人员提供有助于开发高质量微球试剂的基础指导。

二，结合方案设计及优化

尽管随后的一般共价偶联方案通常会有一定程度的微珠涂层，但可以预期需要进行优化以实现所需的活性，性能，稳定性等。优化有很多因素和要点：

A.   反应性基团和偶联化学

1.    配体

由于活性和结合动力学高度依赖于固定分子的取向，因此应仔细考虑可用于偶联或修饰的反应性基团。

2.    微球

生物分子可以通过多种表面化学偶联到聚合物或二氧化硅微球上。可用的表面官能团包括：聚合物-羧基和氨基（最为常用），以及羟基，酰肼和氯甲基； 和二氧化硅-硅烷醇，羧基。 本技术说明的第三部分提供了常规的偶联方案。

3.    交联试剂（连接剂，间隔基，活化剂）

有许多化合物可用于修饰或结合到微球或生物分子上的可用反应基上。交联剂可用于“活化”在水性环境中表现出低反应性的基团（例如碳二亚胺与COOH基团的结合），或用于连接彼此不反应的基团（例如NH₂至NH₂）。

B.   微球组成

微球的具体组成将决定性质，例如疏水性或亲水性，正电荷或负电荷，表面电荷密度等。这些特征将对负载量产生一些影响，即生物分子在多大程度上接近该分子。它们也将影响非特异性结合特性，尽管非特异性结合可通过阻滞剂，缓冲液，测试/测定条件（例如样品稀释）等解决。

C.   试剂质量

试剂的质量对于共价偶联的成功以及包被的微球的最终性能至关重要。应遵守制造商关于试剂制备，使用，储存和保质期的指南，以确保活性和稳定性，并防止污染。在共价固定之前，应考虑抗体或其他捕获生物分子的质量（纯度，亲和力，交叉反应性）。

D.   试剂浓度

1.    概述

确定不同试剂（例如配体和连接剂）的适当浓度对于控制表面密度很重要。使用太少可能会导致涂层效果欠佳且活性降低。 过多使用可能会导致微球“超载”（空间效应，活性降低）或可能只是浪费昂贵的试剂。 下面提供了一些指南以及一般共价偶联方案。

2.    蛋白质

共价偶联方案一直主要为蛋白质单层的结合。 构成单层的蛋白质的量将取决于诸如蛋白质的分子量（MW）及其对微球的相对亲和力等因素。 可以通过使用以下公式来估算此数量：

S = (6 / ρSd)(C)

其中S =实现表面饱和所需的代表性蛋白质的量（mg蛋白质/ g微球），

ρS=实心球的密度（g / cm³），

d =平均直径（微米），和

C =给定蛋白质的微球表面容量（mg蛋白质/ m²球表面）。

以牛血清白蛋白（BSA，MW 65 kD）和牛IgG（BIgG，MW 150 kD）的容量数据（C）为基础。 通过将配体的分子量与BSA和IgG的分子量进行比较，可以估算出其他配体的表面饱和度。

计算及偶联方案中列出的试剂体积均基于平均直径为1.0μm的微球。 因此，计算如下：

对于BSA：C〜3 mg / m²，因此：

S =（6 /ρSd）（C）

=（6 /[1.05 g / cm³•1.0µm]）（3 mg / m²）

〜18 mg的BSA可使1克1µm聚苯乙烯基微球饱和。

对于BIgG：C〜2.5 mg / m²，因此：

S =（6 /ρSd）（C）

=（6/[1.05 g / cm³•1.0µm]）（2.5 mg / m²）

〜15 mg的BIgG可使 1克1µm聚苯乙烯基微球饱和。

需要注意的是，得出的计算值被认为是确定最佳蛋白质浓度的起点。 如果偶联效率不高，或者需要很高的包被密度（例如，样品中仅含有痕量的目标分子），则最佳蛋白质浓度可能会大大高于“单层”值（最高10倍）。 相反，如果不需要高活性（例如具有大量靶标的流式细胞仪测定）或不需要高活性（例如空间效应或增加的非特异性结合），则低得多的蛋白质量可能是合适的。

3.    其他生物分子

有许多公开的偶联方案可用于多种生物分子，包括肽，半抗原，激素，药物等。支持研究者参考文献中有关合适生物分子和试剂浓度的方案。使用方程式确定蛋白质单层也可以帮助建立试验浓度。

E.    微球处理

微球处理也可能对偶联过程的结果产生重大影响。 研究人员应考虑可能会影响偶联效率，微球损失等的洗涤程序。在微球处理过程中，应实施控制措施以监测单分散性（例如显微镜检查，上清液，比浊法等）。

F.    其它因素

还可以评估其他参数，包括孵育时间和温度，试剂添加的顺序和速率等。考虑周到的设计，优化和执行包被方案可以开发出高质量的微球试剂。但是，优化的参数和进行的优化量应取决于最终目标和所需的微球特性。

三，样品偶联方案

以下方案旨在为生物分子与带有不同表面基团的微球的偶联提供一般指导。但可能还需要进行优化以实现最佳的活性和稳定性，同时最大程度地减少非特异性结合特性。

A.   羧基修饰的微球

试剂：

1.羧基修饰的微球（通常以10％的固体含量提供）

2.活化缓冲液（pH 4.5-7.5）*（MES缓冲液是常见选择）。

3.偶联缓冲液（pH 7.2-8.5）[应避免使用含有游离胺的缓冲液，例如Tris或甘氨酸。]

4.水溶性碳二亚胺（WSC）[例如 EDC，CMC等] **

5.蛋白质或其他生物分子

6.用30-40 mM的伯胺源淬灭溶液[例如 羟胺，乙醇胺，甘氨酸等]和0.05-1％（w / v）的阻断分子（请参见第二部分，阻断剂）。

7.具有0.01-0.1％（w / v）阻断分子的储存缓冲液（pH 7.0-7.5）

程序：

1.在10mL的活化缓冲液中洗涤1mL（100mg / mL）的微球2次。***

2.第二次洗涤后，将沉淀重悬于10mL的活化缓冲液中，确保微球悬浮良好。 （涡旋，超声处理或滚动应有助于重悬。）注意：微球悬浮液的浓度现在为10 mg / mL。

3.混合时，加入100mg的WSC。 （添加WSC可能会导致结块；通常不会引起太大的关注，应该通过与生物分子孵育来解决[步骤6-7]。）

4.在室温（18-25°C）下反应15分钟，并连续搅拌。

5.在偶联缓冲液中洗涤2次，并重悬于5mL的相同缓冲液中。像步骤2中一样，尽可能确保颗粒被很好地悬浮。

6.在5mL偶联缓冲液中溶解蛋白质（超出计算的单层1-10倍）。结合微球悬浮液和蛋白质溶液。

7.在室温下持续搅拌2-4小时。

8.洗涤，重悬于10mL淬灭溶液中，并轻轻混合30分钟。洗涤并重悬于存储缓冲液中至所需的存储浓度（通常为10 mg / mL）。

9.存放在4℃直到使用。

* 加入WSC后的反应速率取决于pH（随着pH降低，反应速率增加）。

**   EDAC或EDC：1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide

Hydrochloride

CMC：1-Cyclohexyl-2-(2-morpholinoethyl)carbodiimide

Metho-p-toluenesulfonate

备择方案：

1.一步耦合反应，即碳二亚胺，蛋白质和微球在一个步骤中结合在一起，对于耦合较大的分子通常是有问题的，但已有效地用于较小的分子（如类固醇和半抗原）的耦合。

2.可以加入水溶性的磺基-N-羟基琥珀酰亚胺以提高偶联效率。 由N-羟基化合物形成的活性酯中间体替代由WSC形成的邻酰基脲脲中间体（不稳定），对水解更稳定，但仍对要偶联的蛋白质上的胺具有高反应性。

B.   氨基修饰的微球

试剂：

1.氨基修饰的微球（通常以10％的固体含量提供）

2.胺反应性同双功能交联剂（例如戊二醛，酰亚胺酯或NHS酯。）

3.洗涤/偶联缓冲液（pH 6.0-9.0）（请参见第二部分，缓冲液。）

4.蛋白质或其他生物分子（参见第二部分，试剂浓度。）

5.用30-40 mM的伯胺源淬灭溶液[例如 羟胺，乙醇胺，甘氨酸等]和0.05-1％（w / v）的阻断分子[参见第二部分，阻断剂。]

6.具有0.01-0.1％（w / v）阻断分子的储存缓冲液（pH 7.0-7.5）

程序：

1.在10mL的洗涤/偶联缓冲液中洗涤1mL（100 mg / mL）的微球2次。

2.第二次洗涤后，将沉淀重悬于10mL戊二醛溶液中（戊二醛溶解在洗涤/偶联缓冲液中至终浓度10％）*，确保微球完全悬浮。 （涡旋，超声处理或滚动就足够了。）注意：微球悬浮液的浓度现在为10 mg / mL。

3.在室温（18-25°C）下反应1-2小时，并持续搅拌。

4.洗涤2次，重悬于5mL洗涤/偶联缓冲液中，并确保将颗粒完全重悬，如步骤2所示。

5.在5mL洗涤/偶联缓冲液中溶解蛋白质（超出计算的单层1-10倍）。结合微球悬浮液和蛋白质溶液。

6.在室温下连续搅拌2-4小时。

7.洗涤，重悬于10mL淬灭溶液中，并轻轻混合30分钟。洗涤并重悬于存储缓冲液中至所需的存储浓度（通常为10 mg / mL）。

8.存放在4℃直到使用。

*戊二醛应大量添加，以使微球上的氨基饱和，从而避免在配体连接之前微球之间的交联。 添加的数量需要优化，因为戊二醛过多可能会改变蛋白质的天然构象，从而降低其生物活性。

备择方案：

1.除戊二醛外，各种长度的胺反应性同双功能交联剂都可用于形成间隔臂，从而使共价偶联的蛋白质从表面上以不同的长度引出。

2.氨基和醛之间形成的键形成可逆的席夫碱，必须通过称为还原烷基化的方法将其还原，以使键共价。常用的还原剂包括氰基硼氢化钠，胺硼烷和吡啶硼烷。但是，由于每种蛋白质上的几个氨基都与微球上的醛基相互作用，因此有时认为在偶联大多数蛋白质时无需还原这些键，例如抗体。

C.   羟基修饰的微球

试剂：

1.羟基改性的微球（通常以10％的固体含量提供）

2.2 M碳酸钠（活化缓冲液）

3.氰化溴化物（CNBr）

4.乙腈（C₂H₃N）[用于溶解CNBr]

5.蛋白质或其他生物分子（参见第二部分，试剂浓度。）

6.洗涤/偶联缓冲液（pH 8.0-9.0）。 （避免使用含胺的缓冲液，如Tris或甘氨酸，它们会与配体竞争偶联位点。 请参见第二节，缓冲液。）

7.用30-40 mM的伯胺源淬灭溶液。 （羟胺，乙醇胺，甘氨酸等）和0.05-1％（w / v）的阻断分子（请参见第二部分，阻断剂）。

8.具有0.01-0.1％（w / v）阻断分子的储存缓冲液（pH 7.0-7.5）

程序：

1.在10mL的洗涤/偶联缓冲液中洗涤1mL（100 mg / mL）的微球2次。

2.第二次清洗后，重悬于9.5mL的活化缓冲液中，确保微球完全悬浮。 （涡旋，超声处理或滚动就足够了。）

3.在通风橱中，将1g CNBr（或1g CNBr：100mg微球的比例）溶解在0.5mL乙腈中。 （警告：CNBr具有很高的危险性，应在通风橱中使用所有适当的预防措施进行处理。）

4.将CNBr溶液（滴加）添加到搅拌的微球悬浮液中，并使活化反应在室温（18-25°C）下精确地持续2分钟。注意：微球悬浮液的浓度现在为10 mg / mL。

5.在大量的冰冷水中快速洗涤活化的微球，然后用冷偶合缓冲液洗涤。 5mL冷偶合缓冲液（4˚C）重悬微球。将要偶联的配体溶解在5mL偶联缓冲液中，其浓度对应于计算出的单层1-10X过量，结合微球悬浮液和蛋白质溶液。

6.在持续搅拌下，将悬浮液在4°C下保持24小时。

7.洗涤，重悬于10mL淬灭溶液中，并轻轻混合30分钟。洗涤并重悬于存储缓冲液中至所需的存储浓度（通常为10 mg / mL）。

8.存放在4℃直到使用。

备择方案：

1.1-cyano-4-dimethylaminopryidinium tetrafluoroborate可以代替CNBr，因为它是不挥发的，毒性较小的化学药品，具有较长的半衰期。

2.也可以使用Tosyl Chloride, Tresyl Chloride or carbonyl diimidazole活化剂代替溴化氰。

D.   酰肼修饰的微球

试剂：

1.酰肼改性的微球（通常以10％的固体含量提供）

2.洗涤/偶联缓冲液（pH 5.0-7.0）（请参见第二部分，缓冲液。）

3.蛋白质（请参阅第二部分，试剂浓度。）

4.100 mM偏高碘酸钠（NalO₄）

5.具有0.01-0.1％（w / v）阻断分子的储存缓冲液（pH 7.0-7.5）

程序：

A.蛋白质的氧化（注意：该反应对光敏感，应在黑暗中进行。）

1.在1mL的洗涤/偶联缓冲液中溶解或稀释1-10X过量的计算的单层蛋白质。

2.将蛋白质溶液添加到含有1mg偏高碘酸钠的琥珀色小瓶中：20mg蛋白质； 轻轻旋转以溶解氧化剂。

3.不断搅拌下，将样品在室温下孵育30分钟。

4.通过使混合物通过用偶联缓冲液平衡的脱盐柱（例如Sephadex™G25或PD10）终止反应并除去未反应的NalO₄。

B.偶联至肼修饰的乳胶微球

1.在10mL的洗涤/偶联缓冲液中洗涤1mL（100 mg / mL）的微球2次。

2.第二次洗涤后，将微球重悬于9mL洗涤/偶联缓冲液中，确保微球完全悬浮。

3.将9mL的微球悬浮液与1mL的氧化蛋白质悬浮液混合。 （注意：现在浓度为10 mg / mL。）在室温（18-25°C）下混合至少反应6个小时。

4.洗涤，重悬于含有0.05-1％（w / v）阻断分子的10mL洗涤/偶联缓冲液中，轻轻混合30分钟。

5.洗涤，然后重悬于存储缓冲液中至所需的存储浓度（通常为10 mg / mL）。

6.储存在4℃直到使用。

备择方案：

1.    另一种选择是使用戊二醛激活微球，使用的方法与氨基修饰的微球相同。

E.    氯甲基修饰的微球

试剂：

1.氯甲基改性的微球（通常以10％的固体含量提供）

2.蛋白质或其他生物分子（参见第二部分，试剂浓度。）

3.洗涤/偶联缓冲液（pH 7.5）（请参见第二部分，缓冲液。）

4.用30-40 mM（例如羟胺，乙醇胺，甘氨酸等）和0.05-1％（w / v）阻断分子的伯胺源淬灭溶液（请参阅第二部分，阻断剂）。

5.具有0.01-0.1％（w / v）阻断分子的储存缓冲液（pH 7.0-7.5）

程序：

1.在10mL的洗涤/偶联缓冲液中洗涤1mL（100 mg / mL）的微球2次。

2.第二次洗涤后，重悬于5mL洗涤/偶联缓冲液中，确保微球完全悬浮。 （涡旋，超声处理或滚动就足够了。）

3.在5mL洗涤/偶联缓冲液中溶解蛋白质（超出计算的单层1-10倍）。 结合微球悬浮液和蛋白质溶液。注意：微球悬浮液的浓度现在为10 mg /mL。

4.在室温（18-25°C）下持续搅拌2-4小时。

5.洗涤，重悬于10mL淬灭溶液中，在室温下轻轻混合30分钟。

6.洗涤并重悬于存储缓冲液中至所需的存储浓度（通常为10 mg / mL）。

7.存放在4℃直到使用。

注意：氯甲基微球可以分类为预活化的，因为微球上的氯甲基会直接与可用的氨基反应，而无需任何预处理步骤。由于这些氯甲基的高反应性，它们会随着时间的推移在水性悬浮液中脱卤化氢，因此合成后的保存期限有限。 然而，一旦配体被偶联，它们的稳定性就与任何其他配体包被的微球的稳定性相匹配。

四，其它偶联方案

A.   与非功能化聚合物微球的偶联

1.    聚苯乙烯（PS）

可以通过四个步骤将生物分子共价偶联到普通的聚苯乙烯微球上：表面苯乙烯环的硝化；硝基转化为芳族胺基； 芳族胺基团的重氮化形成重氮化合物； 并与蛋白质的酪氨酸残基偶联。

2.    聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）

PMMA微球并未广泛用于配体的共价偶联； 然而，甲酯基将容易与肼反应，产生酰肼反应位点。

B.   与非功能化二氧化硅微球的偶联

已有文献报道了硅烷化的核酸（寡核苷酸，PCR产物）与未修饰的玻璃表面的偶联。可以将这种方法进行修饰，以将硅烷化的生物分子与二氧化硅微球偶联。

C.   表面官能团的转化

可以将微球上的一个表面官能团转化为另一个。例如，胺改性的微球可通过琥珀酸酐反应转化为羧基改性的微球；相反，羧基可通过碳二亚胺介导的二胺的连接而转化为胺基；巯基改性的微球可通过胺官能化的微球反应制得。这些和其他转化可用于拓宽各种配体的连接方案。

D.   小分子的共价结合

小分子（半抗原，激素，药物等）的共价结合可能会带来特殊的困难，需要创造性的解决方案，例如载体分子和各种类型的交联剂的组合。可以使用间隔物/交联剂从小球的表面延伸小分子，从而减少空间位阻并允许小分子与样品中的靶分子相互作用。 具有可用表面基团（例如BSA，聚赖氨酸）的载体分子可能被吸附到微球表面，随后小分子与载体分子的反应基团发生共价偶联。 或者，可以先将小分子与载体分子共价偶联，然后将载体/小分子复合物吸附到微球。 然后可以将吸附的载体分子彼此共价连接，以防止它们从颗粒中解吸/丢失。

五，微球包被工艺评估

在包被程序之后，应采取一些步骤来确保质量。有许多分析和功能方法可用于解决这些问题。例如，存在许多用于确定（或估计）结合生物分子的量的方法，其细节可以在文献中找到。 用文献报道的分子标记的抗生物分子抗体可以提供有关偶联程序的一些成功信息。可以使用总蛋白测定法（例如BCA，Lowry）来确定与微球结合的蛋白量。可以使用荧光或放射性标记的探针和核酸染料来检测固定的核酸。可以使用组合方法来确定分子是否已结合，以及结合的分子是否表现出预期的活性。