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微球物理吸附

发表时间:2021-04-03 20:59

微球吸附

一、吸附概述

目前,将生物配体附着到用作免疫学试验和测定的固相支持物微球上的方法,通常包括吸附到普通聚合物微球上,共价附着于表面功能化微球上以及附着到预先包被有通用结合蛋白质(例如链霉亲和素或蛋白质A)的微球上。

将蛋白质附着到疏水性微球上的原始方法是被动吸附。由于这种方法的简单性和灵活性,因此今天仍然被广泛使用。

以下信息说明了建立有效吸附方案所涉及的一些变量,以便可以轻松地针对特定应用优化列出的通用方案。

吸附机理主要基于吸附配体的疏水部分与微球聚合物表面之间的疏水(范德华力)吸引力。这是大多数疏水性配体(包括免疫球蛋白)的附着方式。 在疏水性配体较少的情况下(或亲水性更高的微球,例如-COOH改性),可以通过离子相互作用和疏水性相互作用进行连接。人血清白蛋白和血红蛋白是此类配体的实例。这样做的重要性在于,其附着部分是由于离子相互作用而引起的配体会受到其悬浮环境条件的影响,与仅通过疏水作用进行附着相比,pH值的变化更有可能导致脱附。因此,我们通常建议将吸附缓冲液的pH值保持在蛋白质的pI或附近。

在抗体的情况下,蛋白质的Fc部分通常比Fab区更疏水,因此更可能被吸附(有助于确保蛋白质以其最具生物活性的方向结合)。但是,抗体可能会以低于最佳方向的方向结合,可以通过添加大量过量的配体来防止这种情况,以确保拥挤,直立地吸附蛋白质。

疏水配体吸附到聚合物微球可以通过两种方式进行:

1.    被动吸附:通过将两者简单地一起孵育固定,即可将目标配体连接到微球上的吸附。由于杂质将通过相对亲和力和相对浓度效应与配体竞争颗粒表面上的空间,因此最大的配体吸附需要使用超纯试剂。 如果杂质的浓度很高,则可能成为主要涂层。

2.    强制吸附:使用沉淀剂将配体“强制沉淀”到微球表面上的吸附,从而避免了对高度纯化的配体的需要。

A.   不同聚合物对吸附效率的影响

大配体在疏水表面上的吸附,发现在用于连接的相同缓冲液中稀释基本上是不可逆的。但是,吸附的配体可被竞争分子(例如蛋白质或表面活性剂)置换。疏水性聚合物的组成影响吸附的配体被置换的能力,从聚合物微球置换的顺序是:

PS/PAA>PMMA>PS/PMMA>PS

还已经表明,在溶液中存在竞争性蛋白质的情况下,蛋白质置换的难易程度是蛋白质组成的函数。测试了三种代表性蛋白质在上述每种聚合物上的置换难易性,每种聚合物的置换顺序为:

纤维蛋白原>免疫球蛋白>白蛋白

吸附的单克隆抗体在上面列出的共聚物上比在纯聚苯乙烯上保留更多的生物学活性,这说明吸附的蛋白容易置换和活性保留之间存在直接关系。吸附蛋白的结构变化导致置换难易程度降低,也有可能导致活性降低。换句话说,蛋白质与疏水表面相互作用的任何机会都可能导致其折叠结构的松弛,并具有熵的增加。 聚合物将决定这种结构松弛的程度。

B.   不同蛋白质对吸附效率的影响

通过研究各种蛋白质在聚苯乙烯表面上的吸附效率,可以开发出吸附蛋白质混合物的方案。这在开发固相免疫测定法以检测纯蛋白质和蛋白质混合物时起着重要作用。

有一项这样的研究,在开发使用蛋白质混合物的吸附方案时,将独立区域定义为需要考虑的重要变量。独立性区域可以定义为添加蛋白质的浓度范围,在该浓度范围内达到表面饱和,并且进一步的结合可以忽略不计。 通过使添加蛋白质的总浓度保持在此独立区域内,可以帮助确保每种蛋白质的最大结合效率。找到这个独立区域的依据是:要吸附的蛋白质的大小和在很小程度上的电荷,以及它们要吸附的微球的表面积。

C.   计算达到表面饱和度的微球/蛋白质比率

大多数吸附应用都是从与微球结合的单层蛋白质开始的。为了确保正确的空间方向并减少非特异性结合的可能性,我们建议添加蛋白质的量要比计算出的单层高3-10倍。 但是,某些应用程序(例如乳胶凝集测试)似乎在单层覆盖范围内效果最好。该单层量可以从以下公式得出:

S= (6 / ρD)(C)

其中S =实现表面饱和所需的代表性蛋白质的量(mg蛋白质/ g微球),

C=给定蛋白质的微球表面容量,其取决于待偶联蛋白质的大小和分子量(mg蛋白质/聚合物表面积m2),

6/ρD=给定直径的微球的表面积/质量(m2/ g) (ρ=微球的密度,聚苯乙烯为1.05 g / cm3),以及

D=微球直径,以微米为单位。

以牛血清白蛋白(BSA,MW 65kD)和牛IgG(BIgG,MW 150kD)为例。计算以及吸附方案中列出的试剂体积均基于平均直径为1.0μm的微球。 因此,计算如下:

对于BSA:C〜3 mg / m2,因此:

S=(6 /ρD)(C)

=(6 /1.05 g / cm3•1.0µm)(3mg / m2

约18 mg的BSA。

对于BIgG:C〜2.5 mg / m2,因此:

S=(6 /ρD)(C)

=(6 /1.05 g / cm3•1.0µm)(2.5mg / m2

〜15 mg的BIgG。

通过将配体的分子量与BSA和IgG的分子量进行比较,可以估算出其他配体的表面饱和度。

注意:对于非凝集测试,如果包被是抗体要结合的抗原,通常,固相上的抗原越多越好。如果包被是IgG抗体(Ab),则随后要结合的抗原必须具有进入固相IgG结合位点的空间,并且可能不需要完全覆盖。 一些有经验的用户报告说,使用的Ab覆盖大约一半的颗粒表面,是乳胶凝集测试的理想选择。

单位换算

微球固体含量(重量)

10%solids       ~0.1g/mL = 100 mg/mL

1%solids        ~0.01g/mL = 10 mg/mL

0.1%solids       ~0.001 g/mL = 1 mg/mL

聚合物密度

PS          1.05 g/cm3

PMMA      1.19 g/cm3

量/线性转换

10-9= nano-

10-6= micro-

10-3= milli-

二、步骤

被动吸附

试剂:

1.聚合微球(通常以10%的固体含量提供)

2.吸附缓冲液(蛋白质pI或接近 的pH的低离子强度缓冲液)

3.纯化的配体

4.储存缓冲液(添加了0.01-0.1%封闭分子的吸附缓冲液)

程序:

1.    用吸附缓冲液将微球稀释至1%的固体含量(10 mg / mL)。

注意:尽管微球分散液的表面活性剂或清洁剂通常有时会干扰结合,但通常无需在使用前清洗微球。如果需要清洗,可以通过离心,透析或离子交换等技术进行清洗。

2. 在吸附缓冲液中溶解适量的纯化配体(通过计算确定)。

3. 将微球悬浮液加入到适当体积的溶解蛋白中,并轻轻混合1-2小时。

注意:通过向蛋白质中添加微球,可以最大程度地提高效率,并且更可能分布吸附。

4. 在不断混合下,将悬浮液在4°C下孵育过夜。 注意:尽管绝大多数的配体吸附都非常迅速地发生,但是可以通过延长温育达到平衡来帮助实现正确的方向。其他选择是在室温下孵育1-2小时,或在37°C下孵育15-30分钟(如果配体不会受到高温的不利影响)。

5. 离心,除去上清液,并将微球沉淀重悬于所需的存储浓度(通常为10 mg / mL)中。 如果需要,可以在此处添加一个单独的阻断步骤。 注意:可以保存上清液以确定游离蛋白质的量,从中可以间接定量吸附的蛋白质的量。确定溶液中游离蛋白含量的常用测定方法是BCA测定法(PierceChemical Company)。

共价偶联到非功能化聚合物微球

尽管在许多情况下将疏水性配体吸附到聚合物微球上是有利的,但有时疏水性吸引力可能不足以抵抗许多分析过程中包括的温育和洗涤步骤。在其他情况下,所讨论的抗体可能无法被吸附并仍然保留其免疫反应性。 对这种情况的一种解决方案是修饰微球的表面,使共价偶联成为一种选择。 以下是可用于此类修饰的方法。

1.一种实用且可重复的普通聚苯乙烯包被方法包括:将聚苯丙氨酸-赖氨酸吸附到聚苯乙烯微球上,然后用戊烷1、5-二甲基戊酸酯活化并偶联所需的配体。聚苯丙氨酸具有两个重要的作用条件。 首先,苯丙氨酸残基与聚苯乙烯表面之间的强疏水相互作用产生了基本上不可逆的吸附。其次,“反应性”氨基的引入提供了一种通过标准化化学方法共价连接的方法。

2.可以将配体直接衍生化并与非官能化的聚苯乙烯微球共价偶联。

三、常见问题解决方案

问题:无法吸收蛋白质。

解决方案:

a.添加更多的配体(更浓缩的溶液)。

b.去除一些表面活性剂,为表面留出配体吸附空间。

c.用可以很好地粘附在颗粒上,并且可以与配体结合中间材料预涂微球。

d.使用不同的缓冲液(不同的pH,离子强度等)。

问题:有很多配体结合,但是没有活性(方向不正确或堆积太紧密)。

解决方案:

a.尝试或多或少的配体。 (吸附分子的方向通常受到空间因素的强烈影响。)

b.使用“表面稀释剂”-另一种生化试剂,它将共吸附到表面上,以防止配体分子彼此之间过于紧密。

问题:清洗除去未结合的配体后,微球会结块。

解决方案:

a.尝试在表面上放置更多的配体。

b.添加阻断剂,例如BSA或非离子表面活性剂,以稳定悬浮液。

问题:配体吸附最初是最佳的,但是延长储存后,发生了脱附。

解决方案:

a.将存储温度(如果在室温下存储)降低到2-8˚C。

b.降低储存缓冲液中阻断剂的浓度。

c.确认存储缓冲液中不包含可能与结合蛋白竞争并随时间推移引起解吸的杂质。


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