微球使用常见技术问题解答

胶体稳定性注意事项

乳胶微球以良好分散的形式在水性悬浮液中提供。它们在没有任何特定原因（例如抗体与抗原的相互作用）的情况下聚集，这是由于范德华力在颗粒之间起作用所致。 其效果是累加的，即由大量原子组成的胶体粒子，粒子彼此“吸引”的距离可以达到0.5 µm。

1.    两个乳胶微球之间的排斥

粒子中的静电排斥力足够强，以使粒子在类似于吸引物的距离上“感觉”到排斥力。推斥力是根据靠近表面的电荷所产生的电势来计算的；该电势称为ζ电势。可以通过实验测量，也可以根据疏水性粒子的滴定电荷进行估算。

2.    两个乳胶微球之间的总相互作用

总的相互作用是通过简单地将吸引力与排斥力相加来计算的。盐浓度为1 mM时，颗粒之间的接触会非常大。当盐浓度增加到100 mM时，势垒要低得多，但仍足以稳定。在盐浓度高达500 mM时，颗粒将聚集。在这种高盐度下，离子型表面活性剂无法保持稳定性，因此需要非离子型表面活性剂。对于亲水性胶乳（例如CML系列），由于“模糊”表面层由结合在表面的可溶性聚合物组成，因此存在聚集的障碍。该层实际上是浓缩的聚合物溶液。当两层被推到一起时，局部渗透压的增加足够高以抵抗显著的压缩。

除了这种强力但短距离的影响外，静电排斥也在此“模糊”层的最外边缘。这种类型的稳定是电子空间稳定，并且非常坚固。

“模糊”层的尺寸是pH和盐浓度的函数。随着pH值的增加，层中的羧基越来越离解，因此层会膨胀。随着盐浓度的增加，电荷逐渐彼此屏蔽，层收缩。但是在非常高的盐浓度下，聚合物层的溶解度降低，达到了临界凝结浓度，可以发生颗粒的聚集。通常，对于亲水性胶乳，这将超过1M氯化钠，从而使这些颗粒更易于在生理强度缓冲液中使用。

粒径问题

简单可见测试：要考虑的因素是良好的可见性，受扩散速率影响的快速响应以及可用的表面积。 0.3 µm至0.5 µm的尺寸有利于可视性，并且扩散迅速。而且，蛋白质吸附的面积相对较大。但是，除非使用高密度颗粒，否则难以通过离心洗涤。尤其是在共价偶联体系中，应去除多余的物质，这意味着经常使用超过1µm的粒径。

剥离或膜测试：这些要求通过网络具有高扩散迁移率的颗粒。因此，大约0.25 µm的尺寸是不错的选择。

光学检测测试：比浊测试通常要求颗粒的上限直径接近0.15 µm。如果尺寸小于此值，则市场上销售的聚集体会增加光散射。光的散射与体积的平方成正比。

其他自动检测系统是围绕来自更大粒子的光散射而设计的。它们使用1.5 µm至5 µm的颗粒，并且可以围绕单个颗粒的散射进行设计。在如此大的尺寸下，每毫升的颗粒数在固体含量为1％时非常少。固体含量为1％的5 µm颗粒每毫升具有6x10⁸颗粒（相比之下，500 nm具有6x10¹¹的颗粒和50 nm具有6x10¹⁴的颗粒）。

附着问题

蛋白质附着的方法是另一个重要的考虑因素。抗体的方向和构象可以决定哪种方法最合适。

如果物理（被动）吸附令人满意，则最常用的颗粒是硫酸盐微球。对于这种类型的表面，大约5-10％的位置是分离良好的一价硫酸盐基团。表面的其余90-95％由聚苯乙烯的堆叠苯环组成。这是一个疏水的表面，可以为蛋白质分子的疏水部分提供足够的吸附位。

通常使用碳二亚胺通过两步法进行共价偶联，得到活性酯中间体。通过羧酸基团和伯胺基团与颗粒连接。如果蛋白质上的胺要与表面连接，则选择羧基改性的胶乳。或者，可以将蛋白质上的羧基用作连接的位点，然后选择具有脂肪胺表面的颗粒。

通过简单的一步温育可以很容易地进行共价偶联。此处利用了蛋白质上的伯氨基，可以选择两种类型的颗粒。醛/硫酸盐和氯甲基颗粒都容易反应以产生有效的共价键。醛/硫酸盐颗粒比氯甲基颗粒更亲水，这可能有助于稳定性。氯甲基表面可能更容易用甘氨酸等小分子阻断多余的位点。

微球使用常见技术问题解答：

1.    聚苯乙烯微球发生聚集，该如何补救？

除非微球被冻过，通常情况下聚集都是可逆的。使用之前，在水浴超声仪中对微球进行超声处理即可使之分散。如果不在活细胞体系中使用微球，还可添加低浓度的Tween™ 20或Triton™ X-100。对于蛋白标记的微球（如NeutrAvidin™微球），应使用尽可能温和的办法来分散聚集体，避免破坏蛋白构象。请注意，微球粒径越小，越容易发生聚集。

2.    按照实验方案建议的方法超声处理羧酸盐修饰的乳胶微球，结果发现溶液中出现泡沫，需要特别注意吗？

泡沫是由Tween™ 20造成的，后者在储液中起到防止聚集的作用。在这种试剂中存在泡沫很正常。

3.    应该使用哪种方法来分散聚集体？

推荐使用水浴超声仪来分散聚集体。不要使用探头超声仪，否则会损伤微球。

4.    如何避免微球聚集？

各种条件都会导致微球聚集。请尽量避免微球接触以下环境：

结冰温度

微生物污染

高盐缓冲液

极端pH

酸性pH会使羧基和磺酸盐基质子化，而碱性pH则会使氨基去质子化。

加热、过度涡旋以及过度超声处理

对于蛋白标记的微球尤其要注意

5.    在实验体系中，蛋白包被的微球出现非特异性结合。有什么产品可以帮助减少这些非特异性作用吗？

非特异性结合可通过封闭液来缓解

6.    如果冷冻了自己的微球，还可继续使用么？

即使短时间冷冻也会导致不可逆的聚集，并可能造成微球变形，不可继续使用。

7.    洗涤和离心后，微球只留下了极少量的沉淀且溶液呈透明状。为什么会出现这种现象？离心并不是收集较小微球的有效方法；即使可以看到小沉淀，仍有不少微粒残留在溶液中。对于直径低于1 µm的微珠，我们建议采用以下任一方法来洗涤：

错流式过滤，因为这些微粒压缩系数极高并可抵抗较高重力而无损伤风险

采用500 kDa MWCO截留分子量透析

注：直径大于>1 µm的微球可在1,300 rpm下离心。